mRNA药物制备的要害技术——切向流过滤的高效应用
时间：2024.07.15
mRNA药物作为一种新型的生物制药技术 ，因其在治疗和预防疾病方面的潜力而受到广泛关注 。切向流过滤（TFF）技术高效率、高接纳率特点 ，在mRNA药物制备中作用很大 。
一、什么是mRNA ？
mRNA是细胞中的一种核糖核酸 ，它携带遗传信息 ，指导细胞制造特定的卵白质 。在mRNA药物中 ，人工合成的mRNA被设计用来编码治疗性卵白质 ，这些卵白质可以用于治疗或预防疾病 。
二、mRNA药物事情原理
编码设计：科学家设计并合成一段特定的mRNA序列 ，这段序列编码了一种治疗性的卵白质 。
通报进入细胞：为了确保mRNA药物有效进入患者细胞内 ，需要一种有效的通报系统如脂质纳米颗粒（LNP） ，对其进行包裹� ；� ，避免mRNA在抵达作用部位前被酶解或无法穿透细胞膜 。
卵白质合成：一旦mRNA进入细胞 ，它就会被细胞的卵白质合成机制识别 ，并指导细胞合成所需的治疗性卵白质 。
通报进入细胞：为了确保mRNA药物有效进入患者细胞内 ，需要一种有效的通报系统如脂质纳米颗粒（LNP） ，对其进行包裹� ；� ，避免mRNA在抵达作用部位前被酶解或无法穿透细胞膜 。
卵白质合成：一旦mRNA进入细胞 ，它就会被细胞的卵白质合成机制识别 ，并指导细胞合成所需的治疗性卵白质 。
三、TFF技术在mRNA药物制备中的应用
1、mRNA生产工艺办法
mRNA的生产工艺办法基本上分为以上三个办法 ，质粒DNA原液制备的基础是转录模板的序列设计 ，制备要领通常接纳质粒DNA扩增 ，也可接纳PCR扩增 。以DNA扩增为例 ，通常接纳工程菌E.coli发酵来扩增 。先进行菌种苏醒 ，质粒DNA的生产经过发酵培养、收获澄清、精制纯化、线性化、分装贮存等办法 。mRNA原液制备主要工艺包括将线性化质粒DNA体外转录（IVT）为mRNA ，进行化学修饰后疏散纯化 ，纯化后的mRNA原液分装冻存 。mRNA制剂的主要工艺包括mRNA-LNP包封制备、纯化、除菌过滤、无菌灌装等 。我们本文将重点讨论哪些办法需要用到TFF工艺 ，如何选择膜包和中空纤维 ，具体用到哪些规格等 。
2、质粒DNA原液制备
上游质粒扩增的主要工艺是通过E.coli发酵 ，培养结束后 ，需要对菌体进行收集 。实验室离心机受限于其操作 ，难以满足商业化规� ；� ，工业上连续流离心机剪切力较高 。而中空纤维有开放式的通道 ，能够处理高固含量、高粘度、剪切敏感的样品 ，并且具有良好的放大能力 。收集接纳750kD/100nm的中空纤维膜柱 ，去除细胞碎片及培养基组分 。接下来接纳高压均质机破碎、超声裂解、碱裂解进行菌体裂解 ，通过深层过滤进行澄清 。为便于层析纯化 ，在层析上样前 ，先接纳TFF进行浓缩和换液 ，以大大减少样品体积 ，同时去除部分RNA、HCP、HCD等杂质 。
依据质粒DNA分子量巨细选用30kD/100kD/300kD ，TMP小于0.5bar 。然后 ，通过层析进行精制纯化 。经过层析后质粒DNA的纯度已经很高 ，凭据线性化办法的需要 ，可以先进行超滤浓缩换液 ，依据质粒DNA分子量巨细选用30kD/100kD/300kD ，再接纳限制性内切酶完成质粒DNA的线性化 。完成线性化后 ，接纳除菌过滤来控制微生物负荷 。
由于质粒DNA为胞内产品 ，并且生产特定长度和序列的mRNA需要高度纯化且线性化的质粒原料 ，整个下游纯化历程工艺路线较为庞大 ，收率不高（30%~40%） ，这造成行业的质粒生产本钱较高 ，如何优化和改良下游纯化工艺 ，成为目前质粒DNA制备环节中急需解决的问题 。
mRNA的生产工艺办法基本上分为以上三个办法 ，质粒DNA原液制备的基础是转录模板的序列设计 ，制备要领通常接纳质粒DNA扩增 ，也可接纳PCR扩增 。以DNA扩增为例 ，通常接纳工程菌E.coli发酵来扩增 。先进行菌种苏醒 ，质粒DNA的生产经过发酵培养、收获澄清、精制纯化、线性化、分装贮存等办法 。mRNA原液制备主要工艺包括将线性化质粒DNA体外转录（IVT）为mRNA ，进行化学修饰后疏散纯化 ，纯化后的mRNA原液分装冻存 。mRNA制剂的主要工艺包括mRNA-LNP包封制备、纯化、除菌过滤、无菌灌装等 。我们本文将重点讨论哪些办法需要用到TFF工艺 ，如何选择膜包和中空纤维 ，具体用到哪些规格等 。
2、质粒DNA原液制备
上游质粒扩增的主要工艺是通过E.coli发酵 ，培养结束后 ，需要对菌体进行收集 。实验室离心机受限于其操作 ，难以满足商业化规� ；� ，工业上连续流离心机剪切力较高 。而中空纤维有开放式的通道 ，能够处理高固含量、高粘度、剪切敏感的样品 ，并且具有良好的放大能力 。收集接纳750kD/100nm的中空纤维膜柱 ，去除细胞碎片及培养基组分 。接下来接纳高压均质机破碎、超声裂解、碱裂解进行菌体裂解 ，通过深层过滤进行澄清 。为便于层析纯化 ，在层析上样前 ，先接纳TFF进行浓缩和换液 ，以大大减少样品体积 ，同时去除部分RNA、HCP、HCD等杂质 。
依据质粒DNA分子量巨细选用30kD/100kD/300kD ，TMP小于0.5bar 。然后 ，通过层析进行精制纯化 。经过层析后质粒DNA的纯度已经很高 ，凭据线性化办法的需要 ，可以先进行超滤浓缩换液 ，依据质粒DNA分子量巨细选用30kD/100kD/300kD ，再接纳限制性内切酶完成质粒DNA的线性化 。完成线性化后 ，接纳除菌过滤来控制微生物负荷 。
由于质粒DNA为胞内产品 ，并且生产特定长度和序列的mRNA需要高度纯化且线性化的质粒原料 ，整个下游纯化历程工艺路线较为庞大 ，收率不高（30%~40%） ，这造成行业的质粒生产本钱较高 ，如何优化和改良下游纯化工艺 ，成为目前质粒DNA制备环节中急需解决的问题 。
3、mRNA原液制备
体外转录（IVT）和修饰是mRNA原液制备的要害工艺 ，涉及多个办法 ，包括转录、5’端加帽、3’端加Poly(A)尾、去磷酸化等办法 ，转录和修饰后 ，可接纳30kD/100kD/300kD的膜包和中空纤维膜柱去除RNA聚合酶、DNA片段、NTPs、加帽酶、dsRNA、抑制剂等杂质 ，并置换buffer 。然后接纳亲和层析、尺寸排阻层析、离子对反相层析、离子交换层析等层析工艺进行精制纯化 ，经过前述超滤、层析等纯化办法后 ，mRNA已经抵达相当的纯度 ，再使用30kD/100kD/300kD膜包或中空纤维膜柱调解原液中mRNA浓度并置换buffer 。接纳除菌过滤来控制微生物负荷进行暂存封装 。
体外转录（IVT）和修饰是mRNA原液制备的要害工艺 ，涉及多个办法 ，包括转录、5’端加帽、3’端加Poly(A)尾、去磷酸化等办法 ，转录和修饰后 ，可接纳30kD/100kD/300kD的膜包和中空纤维膜柱去除RNA聚合酶、DNA片段、NTPs、加帽酶、dsRNA、抑制剂等杂质 ，并置换buffer 。然后接纳亲和层析、尺寸排阻层析、离子对反相层析、离子交换层析等层析工艺进行精制纯化 ，经过前述超滤、层析等纯化办法后 ，mRNA已经抵达相当的纯度 ，再使用30kD/100kD/300kD膜包或中空纤维膜柱调解原液中mRNA浓度并置换buffer 。接纳除菌过滤来控制微生物负荷进行暂存封装 。
4、mRNA制剂制备
mRNA-LNP包封制备是mRNA制剂制备的要害工艺 ，除了脂质身分派方外 ，就是工艺历程的控制了 ，即如何控制mRNA与脂质身分的接触和相互作用历程 ，通过微流控技术以形成稳定、均一、收率高的mRNA-LNP复合物 。mRNA-LNP溶液通过100kD/300kD TFF技术进行浓缩换液 ，mRNA-LNP复合物被截留 ，乙醇、制剂被洗滤 。最后除菌过滤接纳0.22μm除菌级过滤器冗余设置 ，截留细菌等微生物污染物 。最终 ，进行无菌灌装 。
mRNA-LNP包封制备是mRNA制剂制备的要害工艺 ，除了脂质身分派方外 ，就是工艺历程的控制了 ，即如何控制mRNA与脂质身分的接触和相互作用历程 ，通过微流控技术以形成稳定、均一、收率高的mRNA-LNP复合物 。mRNA-LNP溶液通过100kD/300kD TFF技术进行浓缩换液 ，mRNA-LNP复合物被截留 ，乙醇、制剂被洗滤 。最后除菌过滤接纳0.22μm除菌级过滤器冗余设置 ，截留细菌等微生物污染物 。最终 ，进行无菌灌装 。
在mRNA技术在熏染病疫苗领域获得突破性进展的同时 ，mRNA技术在其它领域的应用也正在展开 。我们期待随着科学的进步和技术的生长 ，mRNA技术能够获得更为广泛的应用 ，造福宽大病患！
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